分光光度法

　　在分光光度計中，將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與眾不同波長相對應(yīng)的吸收強度。如以波長（λ）為橫坐標，吸收強度（A）為縱坐標，就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線。利用該曲線進行物質(zhì)定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質(zhì)的方法，稱為紫外分光光度法；用可見光光源測定有色物質(zhì)的方法，稱為可見光光度法。它們與比色法一樣，都以Beer-Lambert定律為基礎(chǔ)。上述的紫外光區(qū)與可見光區(qū)是常用的。但分光光度法的應(yīng)用光區(qū)包括紫外光區(qū)，可見光區(qū)，紅外光區(qū)。

　　波長范圍

　　(1)200～400nm的紫外光區(qū)，(2)400～760nm的可見光區(qū)，(3)2.5～25μm(按波數(shù)計為4000cm<-1>～400cm<-1>)的紅外光區(qū)。

　　儀器

　　紫外分光光度計，可見分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準確度，所有儀器應(yīng)按照國家計量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進行校正檢定。

　　基本原理

　　當一束強度為I0的單色光垂直照射某物質(zhì)的溶液后，由于一部分光被體系吸收，因此透射光的強度降至I，則溶液的透光率T為：

　　根據(jù)朗伯(Lambert)-比爾(Beer)定律：

　　A=abc

　　式中A為吸光度，b為溶液層厚度（cm），c為溶液的濃度（g/dm^3)，a為吸光系數(shù)。其中吸光系數(shù)與溶液的本性、溫度以及波長等因素有關(guān)。溶液中其他組分（如溶劑等）對光的吸收可用空白液扣除。

　　由上式可知，當固定溶液層厚度l和吸光系數(shù)a時，吸光度A與溶液的濃度成線性關(guān)系。在定量分析時，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況（吸收光譜），從中確定最大吸收波長，然后以此波長的光為光源，測定一系列已知濃度c溶液的吸光度A，作出A~c工作曲線。在分析未知溶液時，根據(jù)測量的吸光度A，查工作曲線即可確定出相應(yīng)的濃度。這便是分光光度法測量濃度的基本原理。